Nor dago icebergaren alde ezkutuan?

Haizea Ziarrusta, Maitane Olivares eta Olatz Zuloaga

Gizakiaren jardueren garapena eta kutsaduraren handitzea elkarrekin doaz eskutik doaz, gizakiak, izaki denetik, bere ingurumena kutsatu baitu. Ingurumenaren kutsadura mailaren goranzko inflexio-puntua industria-iraultzak eragiten du baina, gizakiak gizarte moduan ez dio arazo larri horri garrantzirik eman, gizartea eta ekonomiaren ongizatea lortu arte.

“Gizakia naturaren parte da eta haren kontrako guda norberaren kontrako guda da”. Horrela hausnarrarazten zigun arazo honen inguruan Rachel Carsonek 1962. urtean “Udaberri Isila” liburuan, ekologismoaren lehen lan bezala kontsidera daitekeen horretan. Garai berekoak dira (1960 – 1980) ingurumeneko kutsaduraren lehen araudiak eta XX.mendean instalatu ziren hiri zein industriaren ur zikinak garbitzeko lehen araztegiak. Hasiera batean metalek eta patogenoek eragindako kutsadura gutxitzera eta arautzera bideratu baziren ere, konposatu organikoak ez ziren berandu arte urgaineratu.

Hasiera batean, konposatu organiko iraunkorren (persistent organic pollutant, POP, direlakoen) kontrola jarri zen lehentasun gisa, euren metatze-gaitasuna eta toxikotasuna dela eta. Stockholmeko hitzarmenak 12 POP bildu zituen hasierako zerrendan, besteak beste 9 pestizida kloratu, bifenilo polikloratuak, dioxinak eta furanoak. Urteek aurrera egin duten heinean, zerrenda hau 28 konposatura hedatu da baina, beste hainbat daude zerrenda horretan sartzeko zain. Stockholmeko hitzarmenaz gain, Europako Ur Esparruen Zuzentarauak (Water Framework Directive, WFD, delakoak) edota Ameriketako Estatu Batuetako Ingurumenaren Babeserako Agentziak (Environmental Protection Agency, EPA, delakoak) bestelako lehentasunezko konposatuak definitu dituzte, 129 konposatu zerrendatu arte. Denak ezagunak, denak kontrolatuak, denak esperotakoak. Baina, horiek al dira ingurumenera heltzen diren konposatu kezkagarri edota kaltegarri bakarrak? Ezagunak eta araututa dauden kutsatzaile hauek icebergaren punta baino ez dira. Ingurumenera heltzen diren kutsatzaile asko eta asko gizakiaren eguneroko jarduerak sortuak dira, baina ezagutza txikia dugu Pubchem edo Chemspider bezalako datu-baseetan aurki ditzakegun 70 milioitik gorako konposatuek ingurumenean eragiten dutenaz eta sor ditzaketen gaitzez.

Konposatuen jarraipena erronka bihurtuta

Beraz, merezi al du icebergaren alde urperatu ezkutuan zer dagoen kuxkuxeatzea? Kezkatu behar al gaituzte arautu gabe dauden konposatu horiek? Azken urteotan, zientzia-komunitatearen ikusmira icebergaren alde ezkutu horretara bideratu da, besteak beste konposatu farmazeutikoak, garbiketa eta zaintza pertsonalerako konposatuak, kloratuak ez diren pestizidak edota bestelako kimiko industrial emergenteak detektatzera. Horrela, icebergaren puntako ehunaka konposatuen segimendua egin beharrean, alde ezkutuko milaka konposatuen jarraipenean dago orain erronka. Eta, ez da erronka makala kutsatzaile horien detekziorako metodoak garatzen dituzten urpekarientzat!

Urpekari hauen erronka hartzen dugu kimika analitikoan, eta ezezagunak diren konposatuak aurki ditzakegu, materiaren osagaiak banatu, identifikatu eta kuantifikatzeko instrumentuak erabilita.

Kimika analitikoaren erronkak eta garatutako analisi-metodoak instrumentazioaren garapenaren eskutik doaz. Horrela, orain dela gutxi arte, kimika analitikoko laborategietan garatutako analisi-metodoak bideratu dira; hots, magoak izatetik urruti, konposatu ezagun batzuen analisirako metodoak garatu ditugu. Banaka zein ehun bat konposatu determina ditzakegu aldi berean.

Arestian aipatutako erronkak ordea, bestelako paradigma bat azaltzen du eta analisi bideratutik bideratu gabeko analisirako jauzia egin da, kimika analitikako laborategietan milaka konposatu emergenteren eta ezezagunen analisia egiteko.

Analisi bideratuak eta ez-bideratuak

Analisi bideratuan aldez aurretik erabaki behar dugu zer analizatu nahi dugun; analisi ez-bideratuan, aldiz, guztia analizatzen dugu eta ostean erabakiko dugu informazio horretatik guztitik.

Horrela, analisi bideratugabea izeneko tresnak konposatuen identifikazioa bermatzen du, laginaren konposizioa aurretik ezagutu gabe. Analisi ez-bideratua aurrera eramaten dugunean lortzen dugun informazio kantitatea oso handia denez, haren analisiak hilabeteak eraman ditzake. Are gehiago, etorkizunean datuetara itzuli eta konposatu interesgarri berrien bila joatea ere bermatzen du. Bereizmen altuko masa-espektrometria (high resolution mass spectrometry, HRMS, delakoa) daukagu ingurumeneko kutsatzaile organiko emergenteen eta ezezagunen identifikaziorako garatutako erreminta garrantzitsuenen artean.

Masa-espektrometria izeneko analisi teknikak laguntzen gaitu atomoen zein molekulen hatz-marka identifikatzen. Hatz-marka hori lortzeko masa-espektrometroak gas-fasean dauden atomo/molekula ionizatuen masa/karga (m/z) erlazioak neurtzen ditu. Masa-espektrotik atomoen zein molekulen masa zehatza ezagutu daiteke, isotopoen presentzia determinatu eta, molekulen kasuan, apurketa gertatuz gero egitura kimikoaren inguruko informazioa lor daiteke.

Gure hatz-marka izango diren masa-espektroak bereizmen baxu zein altuan lor daitezke. Baina zergatik behar dugu bereizmen altuko masa espektrometroa? Azken horrek, gaitasuna du bereizmen baxuko masa-espektrometroarekin alderatuta m/z erlazioa zehaztasun eta doitasun handiz neurtzeko. Horrek oso gertuko masa duten molekulak desberdintzeko aukera ematen digu. Horrela, 4. irudiko adibidean, thiamethoxam eta parathion intsektizidak ditugu. Konposatu hauen masen arteko desberdintasuna oso txikia bada ere (0,01375 Da), euren formula molekularra eta egitura kimikoa guztiz desberdina da. Bereizmen baxuko instrumentu batekin ezingo genituzke bi konposatu horiek bereizi (ikus 4. irudia, goian), baina bereizmen altuko batekin, ordea, bai (ikus 4. irudia behean)

Hilabeteak eman ditzake gure urpekariak ezkutatuko icebergaren aldean dauden konposatuak identifikatzen. Ohikoa da masa-espektrometria delako kromatografia banaketa-teknikei lotzea icebergaren alde ezkutuan dauden konposatuak banatu eta identifikatzeko. Konposatu horiek identifikatzeko, behar diren hatz-markak bilatu eta ulertu behar ditu, urratsez urrats, puzzle bat izango balitz bezala, modu sistematikoan pieza guztiak aurkitu, lotu eta puzzlea osatu arte. Alegia, konposatua identifikatu arte. Ikus dezagun adibide bat.

Konposatuen analisirako adibidea

Demagun araztegiko ur-lagin baten analisia ez-bideratua egiten dugula. Likido-kromatografiari akoplatutako bereizmen altuko masa-espektrometroak 1000 kromatografia-gailur detektatu ditu, 1000 konposatu interesgarri posible. Baditugu euren masa zehatza eta profil isotopikoak (formula kimiko zehatz bati dagokion isotopoen masak eta ugaritasun erlatiboak). 1000 konposatu horietatik baten m/z 345,11443 Da-ekoa da. Masa horrekin eta bere profil isotopikoari esker, ondoriozta dezakegu molekula ezezagun hori formula molekular hauetako bat dela: C₁₇H₁₉N₃O₃S, C₁₁H₂₀N₇O₂PS, C₁₉H₁₆N₅P eta C₁₅H₂₄NO₄PS. Formula molekular horien guztien masa teorikoa eta lortutako masa esperimentala konparatzen baditugu, errorerik txikiena (-0,00028 Da-ekoa) C₁₇H₁₉N₃O₃S formula molekularrari dagokio. Baina zer da C₁₇H₁₉N₃O₃S? Milioika konposaturen informazioa biltzen duten datu-baseen arabera, badira formula molekular hori duten 14 konposatu.

Haien artean, litekeena da gure konposatu ezezaguna azidotasunaren aurkako omeprazola izatea. Egin dezagun aurrera. Oraingoan, masa-espektroan behatzen den apurketari erreparatuko diogu (hau da, konposatuari energia aplikatu ondoren lortzen diren masa zehatzeko pusketa esanguratsuei).

Konposatu ezezagunak eta omeprazol purua nola apurtzen diren aztertuta, %97ko antzekotasuna dutela ikus daiteke; beraz, badirudi gure susmoa zuzena dela, baina nola ziurtatu benetan gailur ezezagun hori omeprazola dela?

Azken urratsean, gure urpekariak laginean behatutako gailurraren erretentzio-denbora (konposatuen banaketa kromatografikoa egitean, intereseko konposatuak banaketarako erabiltzen den zutabea zeharkatzeko behar duen denbora) omeprazol erreaktibo puruarekin konparatu eta, voila!, bat datozenez, laginean omeprazolik dagoela jakin ez arren, konposatu hori identifikatu ahal izan du urpekariak 1000 seinaleen artean. Eta orain? Prozesu bera egin beharko da beste 999 gailurretan

Hara, urpekari gaixoa! Bidai luzea du gure lagunak icebergaren alde ezkutuko konposatu horiek guztiak identifikatzen!

Orain arte egindako bidaian, gure urpekaria datu-baseetan euren erabileraren edota toxikotasunaren arabera sailkatuta dauden konposatuetara mugatu den arren, badira ordea data-baseetan bilduta ez dauden bestelako konposatu interesgarri batzuk, hala nola transformazio-produktuak.

Transformazio-produktuak

Transformazio-produktuak iturri desberdinetatik sor daitezke: araztegietako ur-tratamendutik zein ingurumenera heldu eta bertan gerta daitezkeen erreakzio kimikoetatik edo biologikoetatik. Transformazio-produktuen azterketak badu bere garrantzia, zenbait kasutan euren toxikotasuna jatorrizko kutsatzailearen baino handiagoa delako. Esaterako, zaintza pertsonalerako produktuen artean, animalietan egindako ikerketa batzuen arabera, eguzkirako kremetan horren ohikoa den benzofenona-3 (BP3) ultramore iragazkiak baino estrogeno-aktibitate altuagoa du benzofenona-1 edo dihidroxibenzofenona (DHB) gisa ezagunagoa den BP3-aren azpiproduktu metilogabetua.

Transformazio-produktuen identifikazioa bereizmen altuko masa-espektrometriaren bidez ere bidera daiteke. Kasu honetan, ordea, ezin izango dugu beti datu-baseetan informaziorik bilatu, erabat ezezagunak direlako gehienetan eta transformazio-produktu horien identifikazioa nolabait bideratu behar delako, adibidez, kutsatzaile jakin baten eraldaketa kimiko posibleen ondorioz sor daitezkeen produktuak aztertuta. Horrela, aurreko adibidean ikusi dugun moduan, masa zehatzetik eta profil isotopikotik formula molekularrak lortuko ditugu.

Formula molekular guztietatik hautagaiak hartzeko, gure jatorrizko konposatuaren eta haren eraldaketa probableetan oinarrituko gara (hau da, I. eta II. faseko oxidazio-, metilazio-, glukuronidazio-… erreakzioetan).

Behin emandako eraldaketa-erreakzioa identifikatuta, molekularen zein gunetan gertatu eman den zehaztu behar da. Eta non auki dezake urpekariak informazio hori? Hain zuzen, apurketari dagokion masa-espektroan. Saia gaitezen adibide batekin berriro ere.

Arestian aipatutako BP3 ultramore-iragazkiak 229,0859 masa zehatza eta C₁₄H₁₂O₃ formula molekularra du, eta bere egituran bi eraztun aromatiko ditu (A eta B), A eraztunean hidroxilo (-OH) eta metoxi (CH₃O-) talde banarekin (ikus 4. irudia). BP3-ari dagokion apurketaren masa-espektroa 4. irudian ikus daiteke. Baina zer gerta dakioke urraburu arrainak bizi diren itsasoko uretan dagoen BP3-ari? Erantzuna ez da hain erraza, BP3 kutsatzailea arrainen ehun eta jariakin biologiko desberdinetan metatzeaz gain eraldatu egin baitaiteke erreakzio desberdinak pairatuta. Esaterako, behatutako azpiproduktu baten masa zehatza 215,0703 Da-ekoa izan da, eta haren profil isotopikoa kontuan hartuta, C₁₃H₁₀O₃ dela ondorioztatu da. Jatorrizko BP3-aren (C₁₄H₁₂O₃) eta azpiproduktuaren (C₁₃H₁₀O₃) formula molekularrak kontuan hartuta, –CH₃ baten galera dagoela ondorioztatu da. Metilo hori galtzeko leku probableena arestian aipatutako metoxi taldean dago eta azpiproduktuarentzako proposatzen den egitura 4. irudian ikus daiteke, dihidroxibenzofenona (DHB), hain zuzen ere.

Prozedura hori behin eta berriz errepikatuta, 5. irudian ageri diren BP3 konposatuaren 18 azpiproduktu determinatu dira urraburu-arrainen ehun desberdinetan eta beraien bizileku den itsasoko uretan. Horretatik guztitik esan beharrekoa da DHB eta dihidroximetoxibenzofenona (DHMB) azpiproduktuek aktibitate estrogenikoak eta antiandrogenikoak dituztela eta BP-3 bera baino toxikoagoak direla. Beraz, ezinbestekoa da icebergaren alde ezkutuan azpiproduktu horiekin nahasita dauden azpiproduktu berriak identifikatzea, ondoren euren toxikotasuna ikertu eta ingurumeneko arriskuen ebaluazio osoa egin ahal izateko.

Masa-espektrometria bidelagun izanik, urpekariak icebergaren argazki osotuago bat jasotzeko aukera du, ikusten dena eta baita ezkutuan murgilduta dagoena ere. Kimika, eta zientzia orokorra aurrera doazen heinean, erronka handiagotan murgiltzeko aukera izango dugu eta gure inguruan dagoenaren argazki definituago bat izateko aukera izango dugu, ehunka edo milaka konposaturen identifikaziotik milioika konposaturen zalantzarik gabeko identifikazioa posible izateraino.

Erreferentzia bibliografikoak

• Sujin Kim and Kyungho Choi, (2014). Occurrences, toxicities, and ecological risks of benzophenone-3, a common component of organic sunscreen products: A mini-review. Environment International. 70, 143–157. DOI: https://doi.org/10.1016/j.envint.2014.05.015
• Milman B., (2015). General principles of identification by mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry, 69, 24-33. DOI: https://doi.org/10.1016/j.trac.2014.12.009
• Kepner, W., (2016). EPA and a Brief History of Environmental Law in the United States. International Visitor Leadership Program (IVLP), Las Vegas, NV.
• Milman B.L., Zhurkovich I.K., (2017). The chemical space for non-target analysis. Trends in Analytical Chemistry, 97, 179-187. DOI: https://doi.org/10.1016/j.trac.2017.09.013
• Ziarrusta H, Mijangos L, Montes R, Rodil R, Anakabe E, Izagirre U, Prieto A, Etxebarria N, Olivares M, Zuloaga O., (2018). Study of bioconcentration of oxybenzone in gilt-head bream and characterization of its by-products. Chemosphere, 208, 399-407. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2018.05.154

---

Egileaz: Haizea Ziarrusta, Maitane Olivares eta Olatz Zuloaga, UPV/EHUko Zientzia eta Teknologia Fakultateko Kimika Analitikoa Saileko, eta Plentziako Itsas Estazioko (PIE) ikertzaileak dira.

---

Hizkuntza-begiralea: Juan Carlos Odriozola

---

Masa-espektrometriari buruzko artikulu-sorta

1. Masa-espektrometria (I). Neoi isotopoetatik elefante hegalariengana
2. A new hero is born: Masa-espektrometria justiziaren zerbitzura
3. Nor dago icebergaren alden ezkutuan?
4. Konposatu galduaren bila
5. Metabolomika: osotasuna, zatien baturaren aurrean
6. Esploratu gabe dauden lurraldeak kartografiatzen: masa-espektrometria bidezko irudia
7. Proteomika: Proteinak eta Masa Espektrometria eskutik helduta