Metabolomika: osotasuna, zatien baturaren aurrean

María Encarnación Blanco

Aurreko mendeko bigarren erdialdean iraultza handia bizi izan zen biologian. Aurrerapen teknologiko eta zientifiko handiak egin ziren (adibide ezagunena dugu DNAren helize bikoitzaren aurkikuntza), eta erredukzionismoa biologiaren arau bihurtu zen, organismo konplexuak deskonposatzen hasi baitziren haiek osatzen dituzten zatiak bakarka aztertzeko. Ondorioz, biologia molekularra asko hedatu zen. Baina, azkeneko urteetan, neurri batean esperimentala eta neurri batean filosofikoa den beste norabide-aldaketa bat ari da gertatzen biologian, sistemaren ikuspegi holistiko edo integral baterantz, osagai indibidual guztien multzoa eta haien arteko elkarrekintzak aztergai bihurtuta.

Aristotelesen esanetan, osotasuna zatien batura baino gehiago da. Aurreko mendeko ikuspegi erredukzionistaren eta gaur egungo sistemen biologiaren arteko desberdintasun horiek alderatu daitezke jakintsu itsuen eta elefantearen kondaira indiarrarekin, arazo ezezagun batetara ikuspegi indibidual edo murriztu batetik gerturatzeak berekin dakartzan mugak islatzen baititu.

Kondaira horretan, inoiz elefante bat ikusi ez duten sei jakintsu itsuk elefante baten bila joan eta ukitzea erabakitzen dute, animaliaren irudi mental bat egiteko. Lehenengoa, elefantearengana gerturatzen denean, estropezu egin eta animaliaren saihetsaren kontra erortzen da. Esperientzia horretatik ondorioztatzen du elefanteak lokatzezko pareta baten antzekoa izan behar duela. Bigarren jakintsuak elefantearen hortza ukitzen du, eta haren forma borobil eta zorrotzetik ondorioztatzen du elefanteak lantza baten antzekoa izan behar duela. Modu bertsuan, gainerako lau jakintsuek elefantearen tronpa, buztana, hanka bat eta belarri bat ukituta erabakitzen dute, hurrenez hurren, ezagutzen ez zuten animalia horrek suge, soka, zuhaitz-enbor edo abaniko baten antza izango duela. Pentsatzen dutenari buruz eztabaidatzean ez dira ados jartzen elefantearen formaren inguruan, izan ere, John Godfrey Saxe-k kondaira horri buruzko olerkian esaten duen moduan “denak neurri batean zuzen zebiltzan arren, denak oker zeuden”. Era berean, sistema biologiko konplexu guztiak behaketa partzialetan bakarrik oinarrituta ulertzen saiatzen bagara, osoak ez diren ondorioak edo ondorio okerrak atera ditzakegu.

Sistemen biologia bizkor hedatu izana teknologia omikoen ondorioa izan da neurri handi batean. Teknologia horien artean, genomika da ezagunena oraingoz, XX. mendearen amaierako eta XXI. mendearen hasierako erronka teknologiko handia Giza Genomaren Proiektua izan baita. Proiektu hori, genomaren sekuentzia osoa ezartzea helburu zuena, 2003an amaitu zen, aurreikusi baino bi urte lehenago. Horrela, zientzialarien komunitateak informazio zehatza eskuratu zuen giza geneen multzo osoaren (hots, genotipoaren) egitura, antolakuntza eta funtzioari buruz.

Genotipoa, neurri handi batean, organismo baten egoeraren arduraduna da. Baina fenotipoa, hau da, sistema biologiko baten ezaugarri fisiko guztien deskribapena (morfologia, garapena eta metabolismoa barne), ingurumen-faktoreen mende ere badago nabarmen. Metabolomika teknologia omikoen baitako azken diziplinatzat hartzen da; fenotipotik gertuen dagoen diziplina da, eta, hortaz, une jakin bateko organismoaren egoera hoberen adierazten duena.

Oraingo aroa baino 1500-2000 urte lehenago jada garrantzi handia zuen metabolitoen azterketak fluido biologikoetan, Txinako medikuntza tradizionalean zein Indian egiten zen Ayurveda-n intsektuak erabiltzen baitziren pazienteen gernuan glukosa-maila altuak detektatzeko. Metabolomikako lehen esperimentuak Nobel saria birritan jaso zuen Linus Paulingek egin zituela esan daiteke, 1971n 250 bat metabolito analizatu baitzituen hatsaren eta gernu-lurrinaren laginetan; horrela ondorioztatu zuen fluido biologiko bateko metabolito-kopuru handi batek sortutako patroi batetik abiatuta sistema biologiko konplexu baten egoerari buruzko informazioa bil daitekeela. Baina metabolomikaren boom handia 90ko hamarkadaren amaieran gertatu zen. 1999an Jeremy K. Nicholsonek metabonomika terminoa sortu zuen “sistema biziek estimulu patofisiologikoen edo genetikoen aurrean ematen duten erantzun dinamikoaren eta multiparametrikoaren neurri kuantitatiboa” deskribatzeko, hau da, informazio genetikoaren edo kanpoko aldaketa baten eraginez izaki bizidun bat zer egoeran dagoen kuantifikatzeko metabolitoen multzoaren azterketaren bidez. Harrezkero metabolomikaren erabilera esponentzialki areagotu da (2018an 4.000 aldiz baino gehiago argitaratu zen metabolomics terminoa PubMed-en) eta hainbat arlotan aplikatzen da, hala nola gaixotasunen azterketan, sendagaien garapenean, zientzia forentsean, ingurumen-analisian, nutrizioan edo toxikologian.

Metabolomika diziplina zabal eta konplexua da, eta hainbat urrats eman behar dira emaitzak interpretatu ahal izateko galdera biologikotik hasita, hau da, arazoaren planteamendutik abiatuta (adibidez, zer alde dagoen izaki osasuntsu baten eta gaixo baten artean, zer aldaketa metaboliko eragiten dituen dieta aldatzeak, zer erlazio dagoen haur baten garapenaren eta sendagai batek harengan duen eraginaren artean, edo zer eragin duen konposatu toxiko batek sistema batean, besteak beste). Lehenengo urratsa, garrantzitsuenetako bat, azterketa diseinatzea da. Tartean sartuta dauden pertsona guztiek urrats guztietan parte hartu behar dute, laginak hartzen direnetik analisi estatistikoa eta interpretazio biologikoa egiten direnera arte. Sir Ronald Aylmer Fisherek esan zuen moduan: “esperimentua egin ondoren estatistikan adituari galdetzea eta post-mortem analisi bat egiteko eskatzea gauza bera da: ziur asko esan ahalko du zergatik hil zen esperimentua”. Esperimentua egiten hasi aurretik gainerako urratsak zehaztu behar dira (lagina hartzea eta tratatzea, lagina analizatzea, datuak tratatzea eta prozesatzea), emaitzak interpretatu ahal izateko.

Metabolomikaren helburua da metaboloma osoa aztertzea, baina, genomarekin edo proteomarekin alderatuta, metaboloma definitzea ez da erraza. Batzuetan esaten da metaboloma dela sistema biologiko batek (organismoa, organoa, ehuna, fluidoa, zelula…) sintetizatutako metabolitoen multzoa. Baina gizakion gorputzean dauden metabolitoetan, konposatu endogenoak ez ezik, jaten dugunaren edo gurekin kontaktuan dagoenaren produktuak ere badaude, hau da, metabolito exogenoak.

Metabolito endogenoak nahiz exogenoak molekula-familia oso heterogeneo bat dira, hainbat egitura, propietate fisiko-kimiko eta kontzentraziorekin. Eta heterogeneotasun hori dela eta, momentuz ezin da metaboloma osoa batera neurtu teknika bakar bat erabiliz. Horregatik, metabolomaren ahalik eta tarte zabalena hartzeko, plataforma analitiko bat baino gehiago erabili behar dira. Bereziki metabolomikaren hasieran erresonantzia magnetiko nuklearra (RMN) erabiltzen zen batez ere. Baina masa-espektrometrian (MS) oinarritutako metabolomikaren ospea areagotzen joan da denborarekin. Ebazpen handiko tresnak garatu dira, hala nola Fourieren transformatu bidezko erresonantzia ziklotronikoa (FTICR), Orbitrapa edo hegaldi-denbora (TOF), eta, gainera, detekzio mugak txikiak direnez eta analisia bizkor egiten denez, gaur egun azterketa metabolomiko gehienetan aukeratzen den teknika MSa da.

Azterketa batzuetan lagina MSan infusio zuzenez sartzen den arren (DI-MS), ohikoena da laginean aldi berean dauden milaka molekula desberdinak ionizatzeko lehiaren ondoriozko ezabaketa ionikoa eta espektroen konplexutasuna murrizten laguntzeko banaketa-teknika bat erabiltzea espektrometroan. Interesatzen zaizkigun analitoen arabera, teknika batzuk ala besteak erabiliko ditugu. Konposatu lurrunkorrak aztertzeko, MSari akoplatutako gas-kromatografia erabiltzen da (GC-MS). MSan oinarritutako metabolomikaren hasieran gehien erabiltzen zen teknika da hori, eta batez ere landareak aztertzeko erabiltzen zen, baina badu eragozpen bat: metabolito ez-lurrunkorrak analizatzeko, deribatizatu egin behar dira, eta, horretarako, tratamendu konplexu eta aspergarri bat egin behar zaio laginari. Metabolito kargatuen kasuan, elektroforesi kapilarra (CE-MS) erabili ohi da. Gaur egun, MSari akoplatutako kromatografia likidoa (LC-MS) da, zalantzarik gabe, gehien erabiltzen den teknika, eta konposatu polarrak nahiz ez-polarrak aztertzeko aukera ematen du. Ez dagoenez metaboloma osoa analizatzeko aukera ematen duen teknikarik, guztiz gomendagarria da teknika osagarriak erabiltzea.

Analisi metabolomikoetan datu asko sortzen dira, eta softwarea eta metodologia espezifikoak behar dira datu horiek guztiak tratatzeko. LC-MS sistematik hiru dimentsioko datu-set bat lortzen dugu eta sinplifikatu egin behar da harekin lan egin ahal izateko; hala, bi dimentsioko matrize bat lortu behar da, “feature” edo ezaugarri zerrenda batekin eta haien intentsitateekin. Sinplifikatu arren, ehunka laginetan milaka feature dituen matrize bat izaten jarraitzen du, eta tratamendu gehiago egin behar zaizkio (normalizazioa, eraldaketa, zentratzea, eskalatzea…), aldagai anitzeko estatistikaren bidez azter daitekeen datu-set bat lortu arte. Datuak tratatzearen helburua da aztertzen ari diren taldeen (gaixoak vs osasuntsuak, gazteak vs zaharrak, tratatuak vs ez-tratatuak…) arteko desberdintasunen zergatiak azalduko lituzketen ezaugarrien (feature) zerrenda bat lortzea, biomarkatzile gisa erabiltzeko proposatu den hipotesiari erantzuten laguntzeko.

Emaitzen interpretazio biologikoa egin aurreko azken urratsa da aukeratutako feature edo ezaugarriak identifikatzea, LC-MS tresnak ematen digun informazioa erabilita (edukitze-denbora, masa zehatza, zatiketa-espektroa), biomarkatzaile gisa aukeratu diren metabolitoen izenak bilatzeko. Metabolito asko eta aniztasun kimiko handikoak daudenez, oraindik ere identifikazioa da LC-MSan oinarritutako metabolomikaren itogunea. Gizakion gorputzean oraindik identifikatu ez diren metabolito asko daude, zientzialarien komunitateak ahalegin handiak egiten dituen arren. Baina datu-baseetan (METLIN, Lipid Bank, KEGG, Lipid Maps edo HMDB, besteak beste) gero eta metabolito gehiago daude erregistratuta. Batzuetan, metabolito horiek identifikatze hutsarekin jada erantzuten zaio egindako galdera biologikoari, baina gehienetan ikerketa-bide berriak zabaltzen dira, arazoa konpontzeko. Adibidez, gaixo dauden gizabanakoetan ibilbide metaboliko berean kontzentrazio-aldaketak detektatzen baditugu zenbait konposatutan gizabanako osasuntsuen kontrolekin alderatuta, jakin dezakegu ibilbide hori hondatuta dagoela, eta, hortaz, zuzenago azter daiteke.

Metabolomika grafenotik eratorritako materialen toxikotasuna aztertzeko erabiltzen da, esate baterako. Grafenoa gaur egungo aurkikuntza handietako bat da: karbono-atomoen bi dimentsioko sare bat da (atomo baten lodierakoa), eta etorkizun handiko propietateak ditu besteak beste gogortasunari, malgutasunari edo eroankortasunari dagokienez. Horregatik, oso erakargarria da hainbat aplikaziotarako. Adibidez, biosentsore gisa edo sendagaien eroale gisa erabil ote daitekeen aztertzen ari da. Baina ia ezagutzen ez den konposatu bat denez, ez dakigu zer eragin izan dezakeen zelulekin kontaktuan jartzen denean. Eta kasu horretan oso erabilgarriak dira teknologia omikoak, haien bidez desberdintasunak bilatu baitaitezke konposatu horien eraginpean egon diren zelulen eta kontrol-zelulen artean, sisteman eragindako aldaketak modu ez-gidatuan aztertuta, aurretiko hipotesirik gabe.

Azterketa metabolomikoak konplexuak dira eta lan eta ahalegin handia egin behar da haiek gauzatzeko, baina oso erabilgarriak dira dagoen arazoa ia ezagutzen ez den kasuetan eta aurretiko informaziorik ez dagoenean analisi gidatu bat egin ahal izateko. Esan dugun moduan, gizakion gorputzean milaka metabolito daude, eta ia ezinezkoa izan daiteke haiek gidatuta aztertzea biomarkatzaile zehatz bat aurkitzeko helburuarekin; lastategi batean orratz bat aurkitzea bezain zaila izango litzateke, baina jakin gabe bilatzen ari garena orratz bat dela.

Egileari buruz: María Encarnación Blanco UPV/EHU Zientzia eta Teknologia Fakultatean doktorea da eta gaur egun ikertzaile-lanetan dihardu Istituto Italiano di Tecnologia ikergunean. Grafenoaren konposatuek burmuinean izan dezaketen toxikotasuna aztertzeko metabolomika nola erabil daitekeen aztertzen ari da, Europako EU Graphene Flagship Project Horizon 2020 Research and Innovation Programme (Grant agreement no. 785219) egitasmoaren barruan.

Masa-espektrometriari buruzko artikulu-sorta

1. Masa-espektrometria (I). Neoi isotopoetatik elefante hegalariengana
2. A new hero is born: Masa-espektrometria justiziaren zerbitzura
3. Nor dago icebergaren alden ezkutuan?
4. Konposatu galduaren bila
5. Metabolomika: osotasuna, zatien baturaren aurrean
6. Esploratu gabe dauden lurraldeak kartografiatzen: masa-espektrometria bidezko irudia
7. Proteomika: Proteinak eta Masa Espektrometria eskutik helduta